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L-α-甘油磷脂酰膽堿的制備、純化及檢測研究進展

發布日期:2017-10-25 中國油脂網

 康世宗1,張海臣2,吳永輝3,谷克仁1,2
 
(1.河南工業大學化學化工學院,鄭州450001;2.吉林工程職業學院,吉林四平136001;
 
3.廣州倚德生物科技有限公司,廣州511340)
 
摘要:L-α-甘油磷脂酰膽堿(L-α-GPC)是動物體內天然存在的水溶性磷脂代謝產物,是乙酰膽堿合成的膽堿源。甘油磷脂酰膽堿能夠有效增強人體的記憶力和認知能力,預防和治療多種疾病。然而國內L-α-GPC的制備、純化和檢測技術相對不夠成熟,較難滿足市場對高質量、高純度L-α-GPC的需求。通過對國內外L-α-GPC的制備、純化及檢測方法進行綜述,進一步為甘油磷脂酰膽堿以及相關產品開發技術提供支持。
 
關鍵詞:L-α-甘油磷脂酰膽堿;制備;純化;檢測
 
中圖分類號:Q545;TQ645.9文獻標識碼:A
 
文章編號:1003-7969(2017)08-0103-05

Advance in preparation, purification and detection of 
L-α-glycerylphosphorylcholine
KANG Shizong1, ZHANG Haichen2, WU Yonghui3, GU Keren1,2
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China;
2.Jilin Engineering Vocational College, Siping 136001, Jilin, China;
3.Guangzhou Yide Biological Technology Co., Ltd., Guangzhou 511340, China)
 
 
Abstract:L-α-glycerophosphorylcholine (L-α-GPC) is a type of water-soluble phospholipid metabolite, which naturally exists in the animal body, and it is also the choline source of preparing the acetylcholine. It can not only enhance the peoples memory and cognitive abilities, but also prevent and treat lots of diseases. It will be difficult to meet the market demand of high-quality and high-purity L-α-GPC without the mature technology of preparation, purification and detection. The methods of preparation, purification and detection of L-α-GPC at home and abroad were summarized, in order to provide support to the development of L-α-GPC and related products.
Key words:L-α-glycerophosphorylcholine; preparation; purification; detection

L-α-甘油磷脂酰膽堿(L-α-GPC)又稱甘油磷酸膽堿、甘磷酸膽堿,是動物體內天然存在的水溶性磷脂代謝產物,經口服后,能到達膽堿突觸末梢并增加乙酰膽堿的合成和釋放[1-2]。L-α-GPC不僅可以作為保健品,促進大腦中乙酰膽堿和磷脂酰膽堿的生物合成,提高人的記憶能力和認知能力,也能有效治療老年癡呆類疾病如阿爾茨海默病,被醫藥界稱為“大腦的防衰老營養素”[3-4]。L-α-GPC還可以保護肝臟,抵抗高脂蛋白的脂肪滲透,起到抗類風濕、抗高血脂和抗動脈硬化的作用。另外L-α-GPC在一定程度上能夠增強人體肌肉力量,提高反應敏捷度[5]。
 
國外對L-α-GPC的研究始于20世紀三四十年代,國內對該產品的研究起步較晚,在質量、規模方面與國外產品相比均存在一定的差距。純度較低的L-α-GPC中可能含有部分色素和非極性雜質,常溫常壓下性質不穩定,不僅藥理作用弱,還有可能產生對人體有害的毒素[6-7]。國內藥用L-α-GPC幾乎全部依靠進口,95%以上的高純度L-α-GPC價格非常昂貴[8-9]。因此,研究和開發高純度L-α-GPC的生產工藝,擴大生產規模以滿足市場對L-α-GPC的需求,具有重要意義。
 
1L-α-GPC的制備方法
 
由于天然存在的L-α-GPC極少,直接從牛乳或者胰臟中提取比較困難,目前國內外制備L-α-GPC方法主要有化學醇(水)解法、非水相酶法、低沸點有機胺催化法和化學合成法[10],整體上可總結為催化水解法和化學合成法。
 
1.1催化水解法
 
目前,磷脂酰膽堿(PC)催化水解的方法有非水相或水相中用生物酶、金屬鈉、甲醇鈉、乙醇鈉、有機胺等催化醇解。磷脂酰膽堿上兩個脂肪酰基(見圖1中虛線標注部分)被水解,斷開1、2位上的酯鍵就可以得到甘油磷脂酰膽堿。甘油磷脂酰膽堿含有一個季銨鹽正電荷和一個磷酸負電荷,其分子結構式如圖2所示。
 
 
 
阮朝濱等[11]利用堿金屬醇鹽作為催化劑,產品為白色固體L-α-GPC結晶,收率達到72.2%。劉磊[12]以堿金屬硅酸鹽固體堿作為催化劑,在最佳反應條件下使大豆磷脂酰膽堿和甲醇發生酯交換反應制備L-α-GPC,收率達到95.1%。Li等[13-15]探索了丙胺、叔丁胺作為催化劑,磷脂酰膽堿的轉化率均可達到98%以上;并對以氫氧化四丁基銨為催化劑的反應進行動力學分析,構建動力學模型,提出該反應可視為準一級反應,反應活化能為21.98kJ/mol[16]。
 
相比其他催化劑,生物酶技術作為一種安全、綠色、高效的催化技術為L-α-GPC的工業化生產開辟一條全新的道路。磷脂酶A1(PLA1)是一類催化磷脂sn-1位酰基催化水解的酶族[17]。其作用機理為:第一步,PC的sn-1位的脂肪酸酰基被水解,生成sn-2-溶血磷脂酰膽堿(sn-2-LPC);第二步,經過自動酰基轉移,sn-2-LPC轉化為sn-1-LPC;第三步,磷脂酶A1再作用于sn-1-LPC中sn-1的脂肪酸酰基得到L-α-GPC。
 
利用以上原理,Chang等[18]以磷脂酶A1催化水解大豆磷脂酰膽堿,抑制了第二步的酰基轉移,得到純度為83.7%的溶血磷脂酰膽堿(LPC),并且產物中沒有檢測到L-α-GPC。El等[19]利用紫外分光法連續準確地測定磷脂酶A1、A2的作用位點和催化機理,并介紹了抑制酰基轉移的方法。Bang等[20]以大豆磷脂酰膽堿為原料,在正己烷-水(體積比5.8∶1)雙相體系中利用磷脂酶A1水解制備L-α-GPC,優化了反應溫度、反應時間、載酶量等工藝參數,然后利用乙醚萃取與硅膠柱色譜純化后得到了99.3%的高純度L-α-GPC,該研究表明相對于單水相的酶催化體系,正己烷-水雙相體系中L-α-GPC產率更高。可見溶劑的不同或界面的疏水性質有所差異,水解產物的產率也不同。
 
常規的單一酶解法制備L-α-GPC用磷脂酶A1作催化,進行酰基的自動轉移。張文喆等[21-22]以復合磷脂酶法(磷脂酶A1+磷脂酶A2)制備L-α-GPC。這種方法雖然未能提高得率,但縮短了反應時間,相對提高了生產效率。周雯君等[23]以磷脂酶A1和磷脂酶A2為復合酶,在水相及非均相微乳體系下分別酶解制備L-α-GPC,得到了最佳工藝條件。Blasi等[24]在微乳體系中,堿性條件下使用磷脂酶A1、A2通過酶解脫酰基反應制備L-α-GPC,轉化率較高。
 
1.2化學合成法
 
Puricelli[25]以D-亞異丙基甘油對甲苯磺酸酯為起始原料,與磷酸膽堿四甲基銨鹽反應,一步制備L-α-GPC,收率達到75%。Song等[26]應用shapless環氧開環反應原理,用(R)-(+)縮合甘油與磷酸膽堿在異丙胺存在條件下通過親核加成制備L-α-GPC。
 
李海林等[27]利用(R)-環氧氯丙烷與芐醇在強堿作用下縮合制備(S)-芐基縮水甘油醚,然后將(S)-芐基縮水甘油醚與氯化磷酸膽堿反應制得L-α-氯化甘油磷酸膽堿芐基醚;再將所得到的L-α-氯化甘油磷酸膽堿芐基醚通過Pd/C加氫反應脫去芐基保護基,最后純化即得L-α-GPC。蘇福男[28]利用一種氯化磷酰膽堿鈣鹽和(R)-(-)-3-氯-1,2-丙二醇為原料,通過膜分離除去氯化鈉等雜質,最后經過離子交換樹脂進行分離制備甘油磷脂酰膽堿,產品純度可達到99.7%。艾海馬等[29]以D-甘露糖醇為原料,經縮酮化、氧化、還原制得D-亞異丙基甘油,再與2-氯-2-氧-1,3,2-環氧磷戊烷進行酯化反應,然后用三甲胺進行氨化,最后水解除去丙叉基得目標化合物L-α-GPC,總收率從9.5%提高到38.6%(以D-甘露糖醇計)。
 
在以磷脂酰膽堿為原料利用合適的催化劑催化脫酰,再進行酰基轉移制備L-α-GPC的工藝中,原料通常為磷脂酰膽堿,無毒無害,產物收率高。但是原料純度要高,否則將會生成很多副產物,影響產品純度并對后期的分離提純造成困難,并且溶劑的回收耗能大,催化劑價格高。另外,水解過程中可能造成手性結構消旋,導致產品旋光度不合格。化學合成法制備L-α-GPC,產品純度高,分離純化容易,但是工藝復雜,操作條件苛刻,部分原料有毒,中間體不易得,對工業化生產造成一定影響。
 
2L-α-GPC的分離純化方法
 
2.1傳統方法
 
通過酯交換反應制備GPC工藝中,反應液中存在其他中性脂類以及脂肪酸甲酯等[30],同時由于原料中往往伴有磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)等雜質,所以水解產物中也含有甘油磷脂酰乙醇胺(GPE)、甘油磷脂酰絲氨酸(GPS)、甘油磷脂酰肌醇(GPI),與目標產物GPC的極性相似,利用簡單的溶劑萃取[31]很難去除這些雜質。早期分離方法主要有沉淀法、重結晶法、溶劑萃取法。這些方法在純化GPC時存在自身的優缺點:溶劑萃取法利于工業化大規模生產,但很難制備出高純度的GPC,萃取過程需要消耗大量有機溶劑,溶劑的回收也將產生很高的能耗;沉淀法主要利用氯化汞等可溶性汞鹽進行分離雜質,重金屬離子的引入和殘留對醫藥級GPC的開發是不符合要求的;重結晶法是將含有水的液態粗GPC用乙醇等溶劑溶解后,蒸發結晶提純GPC,在工業化規模生產方面滿足不了要求。以上方法對產品純度和旋光性都達不到市場需求,無法商業化生產,現已逐漸被淘汰。
 
2.2柱色譜層析法
 
柱色譜層析法分為硅膠柱層析法、氧化鋁柱層析法、離子交換樹脂柱層析法,以及將兩種填料進行聯合層析法。離子交換樹脂柱層析法操作簡單,回收率高,可重復性使用,并能分離性質和結構相似的化學物質,如分離異構體,特別適用于L-α-GPG的純化分離操作[32]。
 
Liu等[33]利用磷脂酶A1酶法水解,然后用離子交換樹脂純化和硅膠柱層析法制備純度高達99.8%的L-α-GPC,最終收率高達78.4%。Zhang等[34]利用D001和D301-111陰離子交換樹脂柱層析法純化磷脂酶A1催化水解產物,利用活性炭進行脫色并去除小顆粒雜質,得到純度高達98.8%的L-α-GPC。周麗等[35]采用以離子交換樹脂為分離介質的柱層析法及活性炭脫色法,對粉末磷脂的醇解反應液進行分離純化。通過篩選,確定了D001樹脂為第一層析柱的分離介質,201×7樹脂為第二層析柱的分離介質,然后利用D113柱對L-α-GPC粗溶液進一步純化,最后經過旋轉蒸發和真空干燥可得到純度達97.1%的L-α-GPC,回收率為84.8%。
 
但離子交換樹脂對L-α-GPC、GPE和LPC的分離度相對來說仍然不是很高,導致產品的回收率低,整個純化周期長[36]。
 
3L-α-GPC的分析檢測方法
 
3.1定性分析
 
對于油狀的L-α-GPC,可利用傳統的檢測手段如紅外光譜(IR)、核磁共振譜(1H-NMR,1H-1HCOSY,13C-NMR,13C-DEPT,13C-1HHSQC,13C-1HHMBC,31P-NMR)、質譜(ESI+離子源,220℃)、LC-MS、旋光度測定、薄層色譜等技術對L-α-GPC進行定性表征[37]。另外,在利用磷脂酶A1催化水解PC過程當中,Ca2+是必需的輔酶因子[38-39],需要除去,原子吸收光譜可以作為輔助手段對產品中Ca2+含量進行監測[37],為L-α-GPC生產過程中雜質控制提供依據。
 
然而對于晶體狀態的L-α-GPC很難利用以上方法進行表征。Oh等[40]公開了一種制備Ⅰ、Ⅱ晶型L-α-GPC晶體的方法,并利用差示掃描量熱儀(DSC)進行表征,Ⅰ晶型L-α-GPC初始溫度147℃并在150℃有吸收峰,Ⅱ晶型初始溫度為62℃并在66℃處有吸收峰;利用X射線衍射法(XRD)對產品進行定性分析,Ⅰ晶型L-α-GPC在衍射角為(9.8±0.2)°、(12.0±0.2)°、(14.3±0.2)°、(15.8±0.2)°、(19.6±0.2)°處有特征峰,Ⅱ晶型在衍射角為(10.3±0.2)°、(12.2±0.2)°、(13.4±0.2)°、(14.8±0.2)°、(20.6±0.2)°處有特征峰,確證了兩種晶型結構。由于晶體狀態的L-α-GPC相比傳統的油狀L-α-GPC純度更高,同時該晶體吸濕性低,存儲期間具有良好的穩定性,所以更易保存。
 
趙成磊[41]以油狀甘油磷酸膽堿為原料,將過氧化鋁層析柱后的L-α-GPC油狀物粗品通過兩步結晶法制備L-α-GPC單晶純品,用CuKα(λ=1.54184×10-10m)光源收集(150±2)K溫度下的X射線單晶衍射數據,在4.89°≤θ≤69.75°范圍內收集4137個衍射點,其中2204個[R(int)=0.0126]獨立點。X射線單晶衍射結果表明該化合物為正交晶系,對L-α-GPC晶型進行了補充,為今后的L-α-GPC在制劑中晶型的選擇提供了參考。
 
3.2定量分析
 
高效液相色譜法是現今普遍采用的定性、定量分析L-α-GPC的方法。由于L-α-GPC在200~800nm全波長范圍內沒有紫外吸收峰,不能用紫外檢測器對其檢測,所以可以用HPLC-ELSD對其定性或者定量分析[42-43],但是該方法使用的流動相一般含有水,對硅膠色譜柱的柱效有一定的損害作用,造成檢測結果穩定性差,并且PC、LPC、L-α-GPC吸水性強,進一步增加結果的誤差。核磁共振氫譜法可以解決此問題,不但避免了樣品中水分對檢測結果的干擾,還可以分別選取化學位移δ=4.40~4.50、4.14~4.16、3.76~3.83處的信號峰作為PC、LPC和L-α-GPC的特征性質子峰,并根據質子峰相對面積與物質的量的對應關系計算三者的相對含量[44],為PC兩步水解過程中檢測L-α-GPC產率提供了一種簡單快速的方法。
 
劉丹等[45]建立了一種非水電位滴定測定L-α-GPC含量的方法,采用高氯酸標準溶液對L-α-GPC樣品進行電位滴定,然后利用二級微商法找到點位突躍點,確定電位滴定終點消耗的高氯酸標準溶液體積[46],從而得出L-α-GPC含量,實驗精密度較高,并且不受溶液渾濁度影響,可以作為定量分析L-α-GPC的新方法。
 
通常定性和定量分析L-α-GPC可將多種方法聯用,以提高檢測的準確性和可信度。
 
4結束語
 
醫藥、食品、保健品等領域對磷脂及其改性產品L-α-GPC都具有很大的需求,并且在未來將有更大的市場。國內有關L-α-GPC的制備、純化、檢測技術不是十分成熟,所以研發適用于大規模生產L-α-GPC的新工藝,提高產品質量,探索簡便、快速的檢測方法具有重要意義。

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